PCR, DNK polimerazynyň katalizinde sistema DNTP, Mg2 +, uzalma faktorlaryny we güýçlendirme faktorlaryny goşmagy aňladýan polimeraza zynjyr reaksiýasy, esasy DNK-ny şablon we kesgitleýji desgalar hökmünde ulanmagyň, Denaturasiýa, garyşdyrmak, giňeltmek we ş.m. ädimleri arkaly in vitro köpeltmek prosesi, gyzyň DNK-ny ene-atanyň şablony DNK-nyň üstüni ýetirýär, vitro-da islendik maksatly DNK-ny çalt we ýörite güýçlendirip biler.
1. “Hot Start PCR”
Adaty PCR-de güýçlendirmegiň başlangyç wagty PCR maşynyny PCR maşyna salmak däl, soň bolsa programma güýçlenip başlaýar.Ulgam konfigurasiýasy tamamlanandan soň güýçlendirme başlaýar, bu aýratyn däl güýçlendirilmegine sebäp bolup biler we gyzgyn başlangyç PCR bu meseläni çözüp biler.
Gyzgyn başlangyç PCR näme?Reaksiýa ulgamy taýýarlanylandan soň, ferment üýtgediji reaksiýanyň başlangyç ýyladyş döwründe ýa-da “gyzgyn başlangyç” döwründe ýokary temperaturada (adatça 90 ° C-den ýokary) goýberilýär, şeýlelik bilen DNK polimeraza işjeňleşýär.Takyk işjeňleşdirme wagty we temperaturasy DNK polimerazynyň tebigatyna we gyzgyn başlangyç üýtgedijisine baglydyr.Bu usul esasan DNK polimerazynyň işjeňligini saklamak üçin antikorlar, ýakyn baglanyşyklar ýa-da himiki üýtgeýjiler ýaly üýtgeýjileri ulanýar.DNK polimerazynyň işjeňligi otag temperaturasynda saklanýandygy sebäpli, gyzgyn başlangyç tehnologiýasy PCR reaksiýalarynyň aýratynlygyny pida etmezden, otag temperaturasynda birnäçe PCR reaksiýa ulgamyny taýýarlamak üçin uly amatlylygy üpjün edýär.
2. RT-PCR
RT-PCR (Tersine transkripsiýa PCR), mRNA-dan cDNA-a ters transkripsiýa we güýçlendirmek üçin şablon hökmünde ulanmak üçin synag usulydyr.Synag prosedurasy ilki dokumalarda ýa-da öýjüklerde jemi RNK çykarmak, Oligo (dT) -ni primer hökmünde ulanmak, CDNA-ny sintez etmek üçin ters transkriptazany ulanmak, soňra bolsa maksatly gen almak ýa-da gen aňlatmasyny kesgitlemek üçin cDNA-ny PCR güýçlendirmek üçin şablon hökmünde ulanmak.
3. Floresan mukdar PCR
Floresan mukdar PCR (Real wagt mukdar PCR,RT-qPCR) PCR reaksiýa ulgamyna floresan toparlary goşmagyň, ähli PCR prosesine hakyky wagtda gözegçilik etmek üçin we ahyrynda şablony mukdar taýdan seljermek üçin adaty egrini ulanmak usulyna degişlidir.Köplenç ulanylýan qPCR usullaryna SYBR Green I we TaqMan degişlidir.
4. Öýlenen PCR
“Nested PCR” iki gezek PCR güýçlendirmek üçin iki sany PCR primeriniň ulanylmagyny aňladýar, ikinji tapgyryň güýçlendiriji önümi maksatly gen bölegi.
Ilkinji jübüt primerleriň (daşarky primerleriň) gabat gelmezligi, belli bir önümiň güýçlenmegine sebäp bolsa, şol bir sebitiň ikinji jübüti tarapyndan tanalmagy we güýçlendirilmegini dowam etdirmek mümkinçiligi gaty az, şonuň üçin ikinji jübüt primer bilen güýçlendirmek, PCR-iň aýratynlygy gowulaşdy.PCR-iň iki tapgyryny ýerine ýetirmegiň bir artykmaçlygy, çäkli başlangyç DNK-dan ýeterlik önümi köpeltmäge kömek edýär.
5. Touchdown PCR
“Touchdown PCR”, PCR sikliniň parametrlerini sazlamak arkaly PCR reaksiýasynyň aýratynlygyny ýokarlandyrmagyň usulydyr.
PCR degip geçende, ilkinji birnäçe sikl üçin gyzdyryjy temperatura primerleriň iň ýokary gyzdyryjy temperaturasyndan (Tm) birnäçe dereje ýokarda goýulýar.Has ýokary gyzdyryjy temperatura, güýçlendirilmedik güýçlendirmäni netijeli peseldip biler, ýöne şol bir wagtyň özünde, has ýokary gyzdyryjy temperatura primerleriň we maksat yzygiderliliginiň bölünmegini agyrlaşdyrar, netijede PCR hasyllylygy azalýar.Şol sebäpden, ilkinji birnäçe aýlawda ulgamdaky maksatly geniň mazmunyny ýokarlandyrmak üçin, gyzdyryjy temperatura adatça her siklde 1 ° C peselýär.Anne temperaturasy iň amatly temperatura düşürilende, galan sikller üçin gyzdyryjy temperatura saklanýar.
6. Göni PCR
Göni PCR, nuklein kislotasynyň izolýasiýasy we arassalanmagy zerurlygy bolmazdan gönüden-göni nusgadaky DNK-nyň güýçlendirilmegine degişlidir.
Göni PCR-iň iki görnüşi bar:
göni usul: az mukdarda nusga alyň we PCR kesgitlemek üçin göni PCR Master Mix-a goşuň;
döwmek usuly: nusgany alandan soň, lizata goşuň, geni çykarmak üçin lyse, az mukdarda lizirlenen adatdan daşary tebigaty alyň we PCR Master Mix-e goşuň, PCR kesgitlemesini ýerine ýetiriň.Bu çemeleşme tejribe işini aňsatlaşdyrýar, wagty azaldýar we arassalama ädimlerinde DNK ýitmeginiň öňüni alýar.
7. SOE PCR
Giňişleýin uzaldyş arkaly gen bölünişi PCR (SOE PCR), PCR önümleriniň biri-birine gabat gelýän zynjyrlary emele getirmegi üçin goşmaça uçlary bolan primerleri ulanýar, şonuň üçin indiki güýçlendirme reaksiýasynda, üstaşyr zynjyrlary giňeltmek arkaly, güýçlendirilen bölekleriň üstüni ýapýan tehnikanyň dürli çeşmeleri. bilelikde bölündi.Bu tehnologiýanyň häzirki wagtda iki esasy amaly ugry bar: birleşme genleriniň gurluşygy;gen sahypasyna gönükdirilen mutasiýa.
8. IPCR
Ters PCR (IPCR), iki primerden başga DNK böleklerini güýçlendirmek üçin ters goşmaça elementleri ulanýar we belli DNK bölekleriniň iki tarapynda näbelli yzygiderliligi güýçlendirýär.
IPCR ilkibaşda goňşy näbelli sebitleriň yzygiderliligini kesgitlemek üçin döredilipdi we esasan gen promouteriniň yzygiderliligini öwrenmek üçin ulanylýar;gen birleşmesi, translokasiýa we transpozisiýa ýaly onkogen hromosomal tertipleşdirmeler;Wirusly gen integrasiýasy, häzirki wagtda köplenç ulanylýar. Sahypa gönükdirilen mutagenez üçin, islenýän mutasiýa bilen plazmidi göçüriň.
9. dPCR
Sanly PCR (dPCR) nuklein kislotasynyň molekulalaryny mutlak mukdarda kesgitlemegiň usulydyr.
Häzirki wagtda nuklein kislotasynyň molekulalaryny kesgitlemek üçin üç usul bar.Fotometriýa nuklein kislotasynyň molekulalarynyň siňmegine esaslanýar;real wagt floresan mukdar PCR (Real Time PCR) Ct bahasyna esaslanýar we Ct bahasy kesgitlenip bilinýän floresan bahasyna laýyk gelýän sikl belgisine degişlidir;sanly PCR nuklein kislotasynyň mukdaryny sanamak üçin bir molekulaly PCR usulyna esaslanýan iň soňky mukdar tehnologiýasydyr.
Iş wagty: Iýun-13-2023